TEL:17312606166（魏經理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：紫外線對人類既有害又有益。本研究旨在探討紫外線C（UVC）對生物體的毒性和安全性，以及相應的生物防御分子機制。，為增加 UVC 照射劑量，使用高效深紫外線發(fā)光二極管（278 nm）照射處于早期發(fā)育階段（受精后 5-6 小時）的斑馬魚胚胎，并評估包括存活率、孵化率、心率和畸形率在內的形態(tài)學表型。與未照射的對照相比，所有暴露于 4.5 mJ/cm2 UVC 的斑馬魚胚胎都存活下來，并且在孵化和心率方面沒有顯著差異。然而，暴露于7.5 mJ/cm2 UVC 的斑馬魚胚胎存活率顯著下降 (37.5%) 和畸形率增加 (81.8%)。因此，選擇 4.5 mJ/cm2 作為斑馬魚胚胎內部生物防御系統(tǒng)抵御 UVC 輻射的極限劑量。對輻照后 3 分鐘和 3 天的胚胎（4.5 mJ/cm2）進行的轉錄組分析（RNA 測序）揭示了斑馬魚胚胎對輻照反應的分子機制。胚胎通過激活p53信號通路迅速對UVC誘導的應激做出反應。在恢復3天后，胚胎表現出信號轉導和轉錄激活因子（STAT）信號通路的激活。據我們所知，這是第一項評估斑馬魚胚胎在 278 nm UVC 照射下的毒理學效應和生物防御分子機制的研究。
簡介：紫外線（UV）輻射由太陽自然發(fā)射，根據波長范圍可分為三種類型：315至400 nm的長波紫外線A（UVA）、280至315 nm的中波紫外線B（UVB）和100至280 nm的短波紫外線C（UVC）。大氣和臭氧層可以完全過濾UVC，只有UVA（太陽紫外線能量的90-99%）和部分UVB（太陽紫外線總能量的1-10%）到達地球表面。紫外線輻射是威脅人類健康的一個顯著風險因素。過度暴露于紫外線會導致白內障、光老化、紅斑、色素沉著和皮膚癌。然而，適當劑量的紫外線輻射可能有益于人類健康，比如治療新生兒黃疸和老年佝僂病的紫外線療法。在三種類型的紫外線輻射中，UVC 是最有能量的，因此也是最危險的。 短波紫外線燈 (254 nm) 常用于水產養(yǎng)殖或醫(yī)療設施中以滅活細菌和病毒，但它也會對人類造成巨大的 DNA 損傷。眾所周知，UVC 對人體有害。 最近，222nm遠紫外線照射在微生物殺菌方面表現出極好的效果，被認為對哺乳動物皮膚是安全的。另一項研究報告稱，207 nm 的紫外光可有效殺死微生物，而不會傷害暴露的人體組織。在 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 大流行期間，皮膚耐受的遠紫外線 (< 240 nm) 因其對包括嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 在內的人類冠狀病毒的高效滅活而備受關注。此外，需要對其他UVC波長（240–280 nm）對活生物體的輻射效力、毒性和安全性進行系統(tǒng)評估。斑馬魚作為動物模型的優(yōu)點包括易于飼養(yǎng)、高繁殖力、快速發(fā)育、發(fā)育早期的光學透明性、與人類的遺傳和解剖高度相似性，以及易于基因操作。斑馬魚胚胎已被廣泛用作毒理學、環(huán)境污染危害研究和藥物開發(fā)研究的模式生物。此外，斑馬魚是皮膚病學領域的合適模型，因為它們在遺傳學和皮膚發(fā)育方面與人類表現出明顯的相似性。Li等人指出，與小鼠相比，斑馬魚是一種更好的人體皮膚疾病模型生物。因此，斑馬魚被廣泛用于模擬人類皮膚疾病，如大皰性表皮松解癥、牛皮癬和黑色素瘤。在過去的幾十年里，紫外線輻射引起的健康風險引起了人們的關注，人類培養(yǎng)細胞或人類皮膚中潛在的基因圖譜也得到了研究。然而，由于使用了不同的組織模型，關于紫外線誘導途徑的具體信息很少。因此，斑馬魚被認為是系統(tǒng)理解紫外線相關現象和基本機制的理想模型。 為什么斑馬魚是研究紫外線輻射影響的合適模型的另一個原因是斑馬魚和哺乳動物之間的光激活和 DNA 損傷修復途徑是保守的。之前的研究已經評估了斑馬魚胚胎中UVA和UVB輻射的毒理學。例如，UVA暴露（320 nm）會導致斑馬魚胚胎中白細胞IL-1β的誘導和炎癥反應。Chen等人報道，UVB輻射（312nm）導致斑馬魚胚胎中junbb基因表達提前，從而導致細胞損傷。然而，與UVC滅活SARS-CoV-2的效率研究相比，關于UVC的毒性、安全性以及生物體對UVC輻射的反應的系統(tǒng)性報告很少。了解生物體如何保護和修復自身免受UVC損傷的潛在分子機制，可能有助于將來更好地利用UVC輻射。在這項研究中，我們研究了不同劑量的高效深紫外線發(fā)光二極管 (UVC-LED, 278 nm) 照射對斑馬魚胚胎早期原腸胚階段的影響。 測量了包括存活率、孵化率、畸形率和心率在內的形態(tài)表型。 此外，耐受 UVC 輻照的胚胎被用于轉錄組分析，以揭示防止 UVC 光損傷的潛在分子機制。
不同劑量UVC輻射對斑馬魚形態(tài)的影響：早期原腸胚階段（5-6 hpf）的健康胚胎暴露于增加劑量的 UVC。 由于照射距離恒定為 50 cm，照射時間逐漸增加。照射后，暴露10 分鐘或更長時間（≥ 15 mJ/cm2）的胚胎在第二天表現出 100% 的死亡率，因此無法獲得相應的形態(tài)學數據。在72 hpf下觀察胚胎形態(tài)，并照射0.5、1、2、3和5分鐘，分別相當于0.75、1.5、3、4.5和7.5 mJ/cm2的UVC劑量，如圖1所示。在 4.5 mJ/cm2 照射下胚胎的存活率為 100%，而在 7.5 mJ/cm2 劑量下觀察到存活率快速下降（37.5%）。對照組顯示出最高的孵化率（96.7±3.3%），而在7.5 mJ/cm2暴露下72 hpf時觀察到最低值（6.7±2.5%）。對照組和暴露≤4.5 mJ/cm2 組的孵化率之間沒有顯著差異。 與對照組相比，所有暴露組的心率均無顯著差異。 盡管用 4.5 和 7.5 mJ/cm2 UVC 照射的胚胎顯示心率下降，但沒有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，在 1.5 mJ/cm2 或更少的 UVC 劑量照射的胚胎中未觀察到畸形。在 3、4.5 和 7.5 mJ/cm2 的 UVC 下的畸形率分別為 2.5%、12.5% 和 81.8%。輻照后獲得的典型圖像如圖 1E 所示。暴露于4.5 mJ/cm2 的主要畸形是尾巴略微彎曲。 暴露于 7.5 mJ/cm2 的斑馬魚胚胎中觀察到更嚴重的發(fā)育畸形，如心包水腫、脊柱彎曲、卵黃囊水腫、尾巴畸形和生長遲緩。
圖 1. 72 hpf 時斑馬魚胚胎的形態(tài)測量。 斑馬魚早期原腸胚階段（5-6 hpf）的胚胎暴露于不同劑量的 UVC（0、0.75、1.5、3、4.5 和 7.5 mJ/cm2）。（A） 照射后斑馬魚胚胎的存活率、孵化率、心率和畸形率。（E） 對照組和UVC照射胚胎的代表性圖像。
UVC輻射誘導生物防御系統(tǒng)的分子機制：盡管觀察到了輕微的畸形，但所有接受 4.5 mJ/cm2 UVC 照射的斑馬魚胚胎都存活了下來，表明這種輻照強度可能時胚胎內部生物防御系統(tǒng)抵御 UVC 輻射的極限。因此，我們在隨后的分析中使用該輻射強度來揭示這種生物防御的分子機制。在 4.5 mJ/cm2 的 UVC 照射后，在 3 mpi 和 3 dpi 收集胚胎進行 RNA-seq 分析，，分別作為對UVC照射的快速反應和晚期反應的測量。圖2顯示了在3 mpi和3 dpi下UVC輻照胚胎的轉錄組圖譜。
圖 2. UVC 照射和對照胚胎的轉錄組圖譜。
對UVC輻射的快速反應：在 22874 個測序的斑馬魚基因中，選擇參數設置為 FDR < 0.05 和絕對倍數變化≥ 1.5 的差異表達基因（DEGs），結果未發(fā)現任何基因。選擇參數設置為p < 0.05，絕對倍數變化≥ 1.5， 共鑒定出96個DEG，包括40個上調基因和56個下調基因。通過分別輸入上調和下調的DEG獲得的生物過程（BP_ALL）類別如圖3A所示。GO 分析是使用免費工具 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 進行的。表達上調基因與細胞過程（GO:0008037，細胞識別；GO:0045216，細胞-細胞連接組織；GO:0034330，細胞連接組織；GO:1903530，細胞分泌調節(jié)；GO:0044763，單體細胞過程）和定位（GO:0051179，定位；GO:0044765，單體轉運；GO:0051046，分泌調節(jié)）有關。幾個下調基因與細胞死亡（GO:0043066，凋亡過程的負調控；GO:0043069，程序性細胞死亡的負調控；GO:0060548，細胞死亡的負調控）和發(fā)育過程（GO:0072359，循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育；GO:0072358，心血管系統(tǒng)發(fā)育）有關。
圖 3、 斑馬魚胚胎對 UVC 照射 (3 mpi) 的快速反應與相同發(fā)育階段對照胚胎的 DEG 生物信息學分析。
生物信息學分析顯示，對UVC輻射反應最快的三種生物轉化是“應激反應”，其次是“防御反應”和“免疫反應”。此外，還研究了UVC輻射調節(jié)的生物途徑，前三個受調節(jié)的途徑是“p53的轉錄調節(jié)”、“Nectin/NECL信號途徑”和“BLIMP-1的轉錄調節(jié)”。IPA軟件預測的最高監(jiān)管網絡如圖3B所示，它與“疾病和功能”有關，如“聽覺疾病、神經疾病、器官損傷和異?！?。與GO分析結果一致，通過通路分析確定了一個下調的“B淋巴細胞分化”網絡，以及一個上調的“細胞-細胞接觸”網絡，該網絡對UVC輻射反應迅速。
我們進一步進行了 qPCR 以驗證快速響應 UVC 照射的頂級調節(jié)生物通路，即 p53 信號通路。 KeyMolnet 軟件預測的 p53 的計算機分子網絡的細節(jié)如圖 4A 所示。該網絡中的15個關鍵基因被選擇用于qPCR。紫外線照射后，p53上游的基因，即ATM絲氨酸/蘇氨酸激酶顯著上調（2.75倍；p?<?0.05），并且p53的表達在UVC照射的胚胎中顯著上調（與對照組相比）（1.3倍；p?<?0.01)。此外，polo 樣激酶 4（plk4）、聚合酶kappa（polk）和 BCL2 結合組分 3（bbc3） 顯著上調。與對照組相比，在 UVC 照射組中發(fā)現細胞周期蛋白依賴性激酶 1（cdk1）顯著下調。
圖4、p53通路參與斑馬魚胚胎對UVC輻射（3mpi）的快速反應的分子機制。
紫外線照射后的遲發(fā)反應：在 3 dpi 斑馬魚胚胎中，在 24,507 個測序基因中，參數 FDR < 0.05 和絕對倍數變化≥ 1.5僅篩選出 9 個 DEG。然而，當選擇參數設置為p?<?0.05和絕對倍數變化≥?1.5共鑒定出192個DEG，包括89個上調基因和103個下調基因。通過分別輸入上調和下調的DEG獲得的生物過程類別如圖5A所示。對于上調基因，與生物調節(jié)（GO:0010817，激素水平調節(jié)；GO:0042592，穩(wěn)態(tài)過程）、細胞代謝過程（GO:0006721，萜類代謝過程；GO:0034754，細胞激素代謝 過程）和對刺激的反應（GO:0009581，檢測外部刺激；GO:0009582，檢測非生物刺激）有關。下調的 DEG 與細胞反應（GO:0022411，細胞成分分解；GO:0044763，單生物細胞過程；GO:1900543，嘌呤核苷酸代謝過程的負調節(jié)；GO:0045980，核苷酸代謝過程的負調節(jié)； GO：0051716，細胞對刺激的反應）和對刺激的反應（GO：0009611，對創(chuàng)傷的反應；GO：0071496，細胞對外部刺激的反應；GO：0042060，傷口愈合；GO：0031668，細胞對細胞外刺激的反應；GO :0043401，類固醇激素介導的信號通路）有關。
圖 5. 斑馬魚胚胎對 UVC 照射 (3 dpi) 的晚期反應與對照胚胎相同發(fā)育階段之間的 DEG 的生物信息學分析。
在紫外線照射3天后，對UVC產生反應的前三種生物轉化是“轉錄的正調節(jié)，DNA模板化”，其次是“細胞群體增殖的調節(jié)”和“細胞死亡”。按 p 值排列的前三個調節(jié)途徑是“STAT 轉錄調控”，其次是“AP-1 轉錄調控”和“NFκB 轉錄調控”。與“疾病和功能”相關的是“皮膚病和狀況、器官形態(tài)、器官損傷和異常”功能。此外，作為對 UVC 照射的晚期反應，“類視黃醇的代謝”和“淋巴樣細胞的擴張”被上調，“傷口愈合”被下調。參與信號轉導和轉錄激活的種子基因1a和stat3在UVC照射下顯著上調。與對照組相比，上游和下游基因的表達，包括atm、CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP）、δ（cebpd）、BCL2凋亡調節(jié)器δ、MCL1凋亡調節(jié)器，BCL2家族成員b（mcl1b）、birc5a、血管內皮生長因子Ab、MYC原癌基因、bHLH轉錄因子a（myca），細胞周期蛋白D2（ccnd2a）在紫外線照射的胚胎中也顯著上調。
圖6、斑馬魚胚胎對UVC輻射（3 dpi）的后期反應中，基于qPCR驗證編碼STAT通路中間產物的基因的表達。
結論：由于 UVC 具有殺菌效果和低皮膚滲透性，預計 UVC 將用于消毒，特別是用于根除 SARS-CoV-2。在這項研究中，我們首次確定了UVC輻射在斑馬魚胚胎中的毒理學劑量及其轉錄組圖譜。斑馬魚胚胎在恢復三天后通過立即激活p53和STAT信號通路來應對應激。我們進行了進一步的哺乳動物研究，以驗證我們在斑馬魚胚胎中的結果。由于不同的UVC波長可能具有不同的效率，因此需要進一步研究。
原文出自：Transcriptome analysis of molecular response to UVC irradiation in zebrafish embryos - ScienceDirect
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